Хламідіоз. 
Методи визначення/діагностики

| | |ХЛАМІДІОЗ — СУЧАСНІ ПІДХОДИ До ДІАГНОСТИЦІ І ЛІКУВАННЮ | |Цитоскопические методи виявлення хламідій | |При цитоскопическом методі разом з пошуком | |цитоплазматических клеток-включений Провачека враховується | |кількість лейкоцитів як показника запалення, і навіть | |додаткову інформацію про наявність супутньої | |бактеріальної мікрофлори, дрожжеподобных грибів, трихомонад| |тощо. | |Свідчення: Гостра фаза захворювання. | |Матеріалом на дослідження служать зіскрібки з уретри у | |чоловіків, і уретри і /чи цервикального каналу в жінок. | |Матеріал беруть спеціальними щіточками чи ложечками | |Фолькмана. Виділення з цервикального каналу видаляються | |ватяним тампоном. Щіточка вводять у канал на 1−2 див, | |обертається 15 секунд. Соскобный матеріал розподіляється на | |матеріальному склі, висушується надворі і фіксується в | |метаноле чи холодному ацетоні. Найбільш популярна забарвлення | |по Романовскому-Гимзе. Після забарвлення препарати | |проглядаються в світловому мікроскопі, використовуючи | |иммерсионный об'єктив (х90). У цьому цитоплазма клітин | |забарвлюється у блакитній колір, ядра в фіолетово-синій, | |цитоплазматические включення визначаються вигляді | |темно-синіх чи рожевих микроколоний і натомість блакитний | |цитоплазми. На стадії елементарних включення хламідій | |офарблюються в рожевий колір, на стадії елементарних тілець | |-в синій. | |Цитоскопический метод широко доступний, але ефективний лише | |при гострих формах інфекції, значно менш ефективний і | |інформативний при хронічних формах захворювання При | |урогенитальном хламідіоз частота виявлення тілець | |Провачека в соскобах уретри і цервикального каналу не | |перевищує 10−12%. Наявність цих тілець підтверджує діагноз | |хламідіозу, проте відсутність виключає наявність | |інфекції. | | | | | |Пряма иммунофлюоресценция (ПІФ) | |Цей метод передбачає пряме виявлення антигенів | |хламідій. При люмінесцентної мікроскопії включення хламідій| |визначаються вигляді зеленої чи жовто-зеленої флюоресценції| |включень на коричнево-оранжевом тлі цитоплазми клітин | |Включення може мати зернисту гомогенну чи змішану | |структуру. | |Показаннями для діагностики хламідійної інфекції цим | |методом є: | |1.Острая фаза захворювання. | |2.Хроническая фаза захворювання | |3 Встановлення етіології хронічного інфекційного | |процесу урогенитального тракту | |4. Вагітність з обтяженим акушерским анамнезом | |5. Безпліддя незрозумілого генезу. | |Діагностична інформативність ПІФ пов’язана з тим, що з її| |допомогою виявляються як корпускулярные, а й | |розчинні антигени хламідій Цей метод залежить від | |можливої зміни тинкториальных властивостей мікроорганізму | |у процесі захворювання і лікування. ПИФ-метод є | |найважливішим скриннинговым методом діагностики урогенитального| |хламідіозу. Його чутливість і специфічність при | |використанні моноклональних антитіл становить | |відповідно 65−90% і 85−90%. Оцінюючи результатів | |треба враховувати, що тільки показники внутрішньоклітинної | |флюоресценції можуть оцінюватися як позитивного | |результату цього тесту під час використання поликлональных | |антихламидийных антитіл, під час використання моноклональних -| |результат вважають за наявності 10 ЕТ до поля зору. | |Соскобные препарати готують як і для | |цитоскопических досліджень. | |Випускають діагностичні набори, містять моноклональні| |антитіла для ПІФ, такі фірми: Syva, Drfco, Kallastad, | |Bartrels, Boots celltech, California Integrated | |Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенти фірм Syva, Difco, | |Kallastad є мічені ФИТЦ моноклональні | |антитіла до основного білку зовнішньої мембрани хламідій, а | |реагенти інших фірм — моноклональні антитіла до | |родоспецифическому хламидийному липолисахариду (ЛПР). У | |Росії ЗАТ «НИАРМЕДИК плюс» при НИИЭМ їм. Н. Ф. Гамалеи РАМН| |випускає моноклональні антитіла до ЛПР хламідій, які | |успішно конкурують із продукцією іноземних фірм по | |якості продукції. Це набір «Хламоноскрин» для | |визначення моноклональних антитіл до родоспецифическому | |липополисахаридному антигену й створили набір «Хламоноскрин-2» для | |визначення моноклональних антитіл до видоспецифическому | |белковому антигену хламідій трахоматис. Набори мають ФС | |42−359 598 і реєстраційне посвідчення МОЗ Росії | |93/ 270/ 9. | |Моноклональні антитіла відрізняються одна від друга по | |спричиненої яскравості світіння, стабільності виявлених форм ЕТ| |і рівня специфічності. Для діагностики хламідій цим | |методом необхідний люмінесцентний мікроскоп. | |У цілому нині, метод ПІФ відповідає критеріям високої | |чутливість і специфічність, але вимагає виконання | |досвідченим, компетентним лабораторним працівником. | |Висококваліфікована експертну оцінку методом ПІФ рідко| |буває доступною, тому середня чутливість його | |знижується. Метод недостатньо чуттєвий і для | |стабільного визначення малих кількостей ЕТ. До того ж | |неможливо перевірити достовірність і негативні результати, і, | |отже, знайти у тому числі хибнонегативні, що| |призводить до зниження чутливості. | | | | | |Иммуноморфологические методи | |Ці методи засновані на виявленні антигенних субстанцій | |хламідій в епітелії та інших тканинах шляхом обробки | |препаратів специфічними антитілами. Антитіла | |діагностичної антихламидийной сироватки з'єднані з | |будь-якої міткою — люминесцирующей (ФИТЦ-антитела) чи | |ферментної (энзим-меченые антитіла). | | | | | |Непрямий метод иммунофлюресценциии | |Непрямий метод иммунофлюресценции застосовують у тому випадку, | |коли немає у наявності ФИТЦ-конъюгата антихламидийных антитіл.| |У таких випадках приготовлений тим самим методом, що у ПІФ| |препарат з клінічних проб обробляють спочатку | |антихламидийными антитілами, отриманими шляхом імунізації | |хламідіями овець, кроликів, мишей чи інших тварин, а | |потім другий сироваткою, специфічною про людське око тваринного, | |що було иммунизировано хламідіями. Антитіла другий | |сироватки конъюгированы з ФИТЦ. Свідчення до застосування і | |специфічність цього методу збігаються з ПІФ. | | | | | |Діагностика хламідій на культурі клітин МсСоу | |Однією з кращих, але водночас найбільш трудомістким | |є метод діагностики хламідій шляхом ізоляції | |збудника на культурі клітин, опрацьованих різними | |антиметаболитами («золотий стандарт») З цією метою зазвичай | |використовують чутливу культуру клітин, оброблену | |циклогексимидом. Чутливість культурального методу по | |порівнянню з ПЛР становить 70−80%, але водночас він | |перевершує молекулярнобіологічні методи діагностики по| |специфічності. У літературі описані випадки виявлення | |хламідій трахоматис методом ПЛР при негативних | |результатах культурального тіста й навпаки. | |Показаннями для діагностики хламідійної інфекції цим | |методом є: | |1 Вагітність з обтяженим акушерским анамнезом. | |2. Оцінка ефективності проведеного антибактериального | |лікування. | |3. Виявлення чутливість проблеми та резистентності до | |антибактеріальних | |препаратів. | |4. Виявлення хламідій у ВІЛ-інфікованих чи осіб із | |вторинними иммунодефицитными станами (онкологічні | |хворі після проведених курсів променевою і хіміотерапії, | |трансплантації кісткового мозку; особи, отримують | |иммунодепрессанты; хворі на вірусний гепатит і | |туберкульозом). | |5. Безпліддя незрозумілого генезу. | |6. Встановлення етіології хронічного інфекційного | |процесу урогенитального тракту. | |Культуральний посів є референс-методом в оцінці | |ефективності антибактериального лікування. При дослідженні | |биопроб методом ПЛР після курсу хіміотерапії у деяких | |випадках можна було одержати «хибнопозитивні із клінічною | |погляду» результати. Це з тим, що організувати неможливо| |однозначно оцінити життєздатність і патогенність | |мікробної клітини виходячи з виявлення фрагмента її | |геному, використовуючи лише дані молекулярно-біологічних | |методів. І тут для дослідження клінічного | |матеріалу з допомогою культурального посіву мікробні клітини,| |втративши ці важливі із клінічною погляду властивості, | |не дадуть зростання клітинної культури. | |Для транспортування і збереження клінічного матеріалу | |використовують спеціальну сприятливе середовище (транспортна | |середовище). Вона розливається в пенициллиновые флакони по 1 мл і | |зберігається за нормальної температури + 4 ° З (у спільній камері побутового | |холодильника) протягом 2-х місяців. Склад транспортної | |середовища: середовище MEM з додаванням 10% сироватки великого | |рогатого худоби і антибіотика гентамицина концентрації 50 | |мкг/мл. | |Клінічний матеріал після перенесення в транспортну середу| |зберігається у спільній камері холодильника за нормальної температури + 4 ° | |З повагою та, протягом дві доби може бути його доставили | |лабораторію. | |Процедура посіву | |1. Обробка одноденної клітинної культури МсСоу 1% | |розчином ДЕАЕ декстраном за тридцяти хвилин. | |2. Зараження опрацьованих клітин матеріалом, отриманих від | |хворих. | |3. Центрифугування заражених клітин при 2500 g протягом| |45 хвилин. | |4. Відмивання клітин сприятливим середовищем. | |5. Додавання до клітинам ростовий середовища, що містить | |циклогексимид. | |6. Инкубирование клітин на протягом дві доби при +36 ° З. | |7. Виявлення хламідій у клітинах методом прямий | |иммунофлюоресценции чи ПЛР. | |Реальний строк результатів цим методом — сім | |днів. | | | |Нині у літературі зростає кількість повідомлень про | |випадках резистентності хламідій до антибактеріальних | |препаратів (еритроміцину, тетрацикліну, доксициклину, | |фторхинолонам). Цінність культурального методу полягає у | |тому, що якого є поки що єдиним методом, що дозволяє| |вибрати антибактеріальний препарат на лікування хламідійної | |інфекції і оцінити ефективність антибактеріальної терапії.| | | |Схема методу виявлення стійкості хламідій трахоматис до | |антибактеріальних препаратів | |-Хламидийным изолятом, виділеним від хворого при сівбу, | |заражають чутливі клітини. | |-До заражених клітинам додають ростовую середу, що містить | |антибіотик. | |-Заражені клітини инкубируют 5 днів із температурі + 36 °| |З. | |-Чутливість хламідій до антибіотика визначається по | |придушення інфекції в заражених клітинах. Процедура | |тривала, займає за часу два тижні. | | | | | |Діагностика Chlamydia trachomatis методом полімеразної | |ланцюгову реакцію | |Дорожнеча, тривалість і трудомісткість | |мікробіологічного виділення хламідій у культурі | |істотно утруднює використання цієї процедури в | |рутинної лабораторної діагностики. У літературі нагромаджено | |великий клинико-лабораторный досвід з використання методу | |ПЛР виявлення хламідій трахоматис. Особливу увагу при | |використанні слід приділяти, безперечно, питанням | |правильна інтерпретація отриманих результатів. | |Екстремально високі показники чутливість проблеми та | |специфічності ПЛР роблять цю методику багато в чому | |революційної в лабораторної діагностики. Основними | |мішенями при виявленні хламідій трахоматис є | |нуклеотидная послідовність видоспецифической | |криптической плазмідами, послідовність головного білка | |внутрішньої мембрани, рибосомальные гени. | |Ця реакція є багаторазово повторювані| |цикли синтезу (амплификацию) специфічної області | |ДНК-мишени у присутності термостабильной ДНК-полимеразы, | |дезоксинуклеотидтрифосфатов, відповідного сольового | |буфера і олигонуклеотидных затравок-праймеров, визначальних| |кордону амплифицируемого ділянки. Кожен цикл складається з | |трьох стадій з різними температурними режимами. У першій| |стадії при 94 ° З відбувається поділ ланцюгів ДНК, потім | |при 56−58 ° З — приєднання (відпал) праймеров до | |комплементарних послідовностям на ДНК-мишени, і за | |температурі 72 ° З протікає синтез нових ланцюгів ДНК шляхом | |добудовування ланцюгів праймеров у бік 5' -3'. У | |кожному циклі відбувається подвоєння числа копій | |амплифицируемого ділянки, що дозволяє за 25−40 циклів | |напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою вибраних | |праймеров, у кількості, достатньому на її детекции з | |допомогою електрофорезу чи альтернативними йому технологіями | |У порівняні з широко застосовуються імунологічними | |тестами ПЦР-діагностика має низку переваг: | |-високою і регульованої специфічністю, зумовленої лише | |нуклеотидної послідовністю, застосовується у даної | |діагностичної системі; | |-високої чутливістю, що дозволяє диагносцировать не | |лише гострі, а й латентні інфекції (можливо виявлення | |навіть одиничних бактерій чи вірусів); | |-хімічне подібність всіх нуклеїнових кислот дозволяє | |розробляти універсальні процедури виявлення | |різних інфекційних агентів, | |-можливістю ідентифікації збудника протягом 4,5−5 | |годин. | | | |Доставка біоматеріалу в ПЦР-лабораторию виробляється у | |холодовом термоконтейнере чи термосі з льодом. Важливою | |характерною рисою ПЛР-діагностики є | |щодо низька вартість устаткування проведення | |аналізу, поєднана зі універсальністю методу, що | |дозволяє виявляти всього спектра клінічно актуальних | |інфекційних агентів. | | | |ПЦР-лаборатория повинна бути розділена на зони (кімнати). | |Слід мати щонайменше двох кімнат | |-пре-ПЦР-помещение, де проводиться обробка клінічних | |зразків, виділення ДНК, приготування реакційної суміші | |для ПЛР і постановка ПЛР (за наявності умов останні двоє| |етапу рекомендується також здійснювати додатковому | |окремому приміщенні), у тих приміщеннях забороняється | |проводити й інші види робіт з інфекційних агентів | |(мікробіологічний аналіз, ІФА, інші діагностичні | |тести), ПЦР-діагностика яких проводиться у цій | |лабораторії. | |-пост-ПЦР-помещение, де проводиться детекция продуктів | |амплификации, в ПЦР-помещении допускається використовувати | |інші методи детекции інфекцій, діагностика яких | |проводиться у цій лабораторії. Кімнату детекции продуктів| |амплификации (пост-ПЦР-помещение) слід розташовувати як | |можна далі від пре-ПЦР-помещений. Слід виключити | |рух повітряного потоку з пост-ПЦР-помещения в | |пре-ПЦР-помещение. | |У кімнаті приготування реакційної суміші й у кімнаті | |обробки клінічних зразків необхідно встановити | |ультрафіолетові лампи, робочі поверхні до лабораторій | |повинні оброблятися дезінфікуючими розчинами. | |Свідчення для діагностики З. trachomatis методом ПЛР | |1. Гостра фаза захворювання | |2. Хронічна фаза захворювання | |3. Встановлення етіології хронічного інфекційного | |процесу урогенитального тракту. | |4. Вагітність з обтяженим акушерским анамнезом. 5 | |Безпліддя незрозумілого генезу. | |6. Контроль ефективності проведеного антибактериального | |лікування. | |У разі виявлення фрагмента ДНК хламідії трахоматис після | |курсу хіміотерапії слід провести культуральне | |діагностику щоб уникнути «ложноположительного з | |клінічної погляду результату». Якщо проведення | |культуральної діагностики неможливо, необхідно через | |5−6 тижнів (повне відновлення эпителиального покриву | |сечостатевих шляхів) провести повторне дослідження методом | |ПЛР. | |7. Виявлення хламідії у ВІЛінфікованих осіб, хворих | |туберкульозом, на вірусний гепатит і з вторинними | |иммунодефицитными состояними (онкологічні хворі після | |курсів хіміоі променевої терапії, трансплантації кісткового | |мозку, отримують імуносупресивну терапію). | |У 1991 року компанія Хоффман-ла Рош ЛТД отримала запрошення від | |компанії Cetus правничий та патенти використання ПЛР. У цьому вся| |року була створено Roche Molecular Systems, займається | |виключно питаннями розвитку й удосконалення ПЛР. У| |1992 року було впроваджені перші стандартизованные | |тест-системи для клінічної ПЛР-діагностики AMPLICOR | |Chlamydia trachomatis, а 1993 року було розпочато виробництво | |цих тест систем. Численні проведені дослідження | |показали високу чутливість і специфічність даного | |набору. Це й дозволило отримати даної тест-системе | |сертифікат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 року. | |1995 року з’явився новий набір AMPLICOR Chlamydia | |trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одночасній їх | |детекции лише у пробірці. У тесті використані | |биотинилированные праймери (СР24/СР27) з криптической | |плазміди З. trachomatis. Чутливість тесту становить | |10 копий/мл, специфічність 99,6%. Тест-система включає: | |набір для збирання й транспортування зразків, набір для | |виділення ДНК з цервикальных, уретральных зразків і сечі,| |набір для амплификации і детекции. Усі набори | |стандартизовані, повністю готові для використання, мають | |внутрішній контроль, система захисту від контамінації. | |Науково-виробничої фірмою «Литех «при НДІ | |фізико-хімічної медицини МОЗ РФ випускається набір | |реагентів «Полимик «у трьох окремих наборів для | |визначення відповідно Chlamydia trachomatis, | |Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Кожен набір | |"Полимик» комплектується окремим набором виділення ДНК| |з биопроб. Інструкція щодо застосування набору реагентів | |рекомендована до утвердження експертної комісією Комітету | |знову медичної техніці МОЗ РФ (протокол No 3 від | |18.03.96 р.) і затвердженої Міністерством охорони здоров’я РФ | |17.05.96 р. (ТУ 9398−405−17 253 567−96). | |До складу реакційної суміші набору «Полимик» входить | |внутрішній контроль (рекомбінантна плазмида, що містить | |фрагмент-вставку розміром 308 н.п.). Цей компонент | |дозволяє контролювати процес проходження реакції | |амплификации, і навіть тестувати його присутність серед пробах речовин,| |що пригнічують ПЛР. Смуга, відповідна внутрішньому | |контролю, має виявлятися як у позитивному й у | |негативному контролях, і переважають у всіх тестируемых пробах. | |При виділенні ДНК з біопроби («Набір виділення ДНК») | |використовується метод екстракції ДНК з клітин хламідій з | |допомогою гуанидина тиоцианата і зв’язування що | |нуклеїнових кислот із часточками крупнопористого скла. Це | |дозволяє оптимізувати умови виділення, тож підготовки | |проб для амплификации, і навіть зменшити кількість | |маніпулювання зразком. У цьому все маніпуляції проводяться| |лише у пробірці. Вихід хромосомної ДНК становить 70−80% | |за результатами визначення числа колонієтворних одиниць | |клітин Acholeplasma laidlawii (штам мікоплазм, узятий в | |ролі стандарту) як у чистої культури, і при| |додаванні цих клітин до клінічного матеріалу, не | |який містить визначених інфекційних агентів. | |Після закінчення ПЛР продукти амплификации фракционируют | |методом електрофорезу в 1,5% агарозном гелі. | |Аналіз результатів діагностики | |1. У позитивному контрольному зразку для хламідій | |виявляється смуга розміром 501 н.п. | |2. У негативному контрольному зразку смуга, | |відповідна фрагментами геному хламідій, повинна | |відсутні. Поява смуги в негативному контролі | |свідчить про контамінації компонентів набору. | |3. У аналізованої пробі відсутність смуги суворо лише на рівні| |відповідного контролю свідчить про відсутність | |збудника в пробі, наявність смуги, відповідної по | |электрофоретической рухливості позитивному контролю, | |свідчить про наявність хламідій у клінічній пробі. | |4. В усіх життєвих зразках виявляється смуга оранжево-червоного | |кольору, відповідна внутрішньому контролю розміром 308 | |н.п. Отримані результати можна документувати | |фотографуванням гелів з допомогою помаранчевого чи | |интерференционного (594 нм) світлофільтра. З використанням| |відеосистеми «Gel-doc «можливо документування | |результатів електрофорезу як комп’ютерного файла, | |доступного будь-яким додатків «Windows». | |Набір «Полимик» слід зберігати за нормальної температури — 18−20 ° З| |протягом усього терміну придатності (6 місяців). Допускається, | |збереження і транспортування набору за нормальної температури не вище 0| |° градусів трохи більше однієї доби. | |На третій квартал 1999 р. МОЗом Росії | |крім набору «Полимик» дозволені такі діагностичні| |набори щоб виявити хламідій трахоматис методом ПЛР в | |ролі виробів медичного призначення: | |набір реагентів амплификационный визначення ДНК | |хламідій (Хламидия-Ампли-тест) ТУ 9398−402−18 137 053−96 | |виробництва АТ «ВНЦМДЛ», Москва; | |набір реактивів виявлення нуклеотидних | |послідовностей хламидия трахоматис методом ПЛР (Мотлох | |Am) ТУ «9398−403−29 032 954−96 виробництва ЗАТ «Впровадження | |систем до медицини». Москва, | |набір реагентів виявлення ДНК хламідій трахоматис | |методом ПЛР (Хлам-Ген) ТУ 9398−412−46 482 062;97 виробництва| |НПФ «ДНК-технология», Москва. | | | | | |Переваги й недоліки різних методів виявлення Chlamydia | |trachomatis | |(Taylor-Robinson Про., Thomas B. J, 1991, з доповненнями Балакун В. М,| |Бочкарьов О.Г., Парфьонова Т. М., 1999) | | | |Характеристика/ Метод | |ПІФ | |Культуральний посів | |ИФА-методы | |ПЛР | | | |Обстежуваний матеріал | |Будь-який | |Більшість | |Обмеження через неспецифичности реакцій | |Будь-який | | | |Значення правильно узятих проб | |Вирішальне | |Вирішальне | |Вирішальне | |Вирішальне | | | |Умови транспортування проб | |Якщо препарат фіксованийумови байдужі | |Швидка доставка чи зберігання при низької температури | |Дарма, якщо проба узята в буфер | |Швидка доставка чи зберігання при низькою to менш важлива, ніж для | |культури клітин | | | |Умови зберігання | |На короткий час при +4°С довго при -20 °З | |+4°С — добу-дві. Длит збереження до рідкому азоті | |3 -5 днів із +4°С Заморожування знижує чутливість | |На короткий час + 4 °C, два тижні - 20° С Тривалий час — в | |рідкому азоті | | | |Перевірка адекватності взяття матеріалу | |Мазки оцінюють під час тестування | |Не практикується | |Не практикується | |Визначається, чи ДНК. | | | |Потреба спеціальне устаткування | |Люмінесцентний мікроскоп | |Центрифуга | |Комплект для ІФА | |Амплификатор й устаткування для електрофорезу | | | |Обробка проб | |Проста | |Трудомістка | |Стає простіше нових тестів | |Потребує суворої обережності, ніж забрудніть ДНК | | | |Читання результатів | |Суб'єктивне і обтяжлива | |Суб'єктивне помірковано обтяжлива | |Об'єктивне, Просте | |Об'єктивне, просте | | | |Час виконання | |30 хвилин | |12−72 години | |3 години | |4,5−5 годин | | | |Способи перевірки результатів | |Повторний перегляд | |Повторний перегляд | |Повторення тесту | |Повторна проба чи перетравлювання эндоуклеазой | | | |Результат залежить від наступних причин: | |Досвіду микроскописта | |Чутливості клітинної культури | |Властивою потужності тесту | |Потребує хорошого контролю та отсуствия контамінації | | | |Здатність до підтримки штами | |Ні | |Так | |Ні | |Ні | | | |Використання як контролю ефективності лікування | |Обмежено | |Рекомендується | |Обмежено | |Рекомендується з обмеженнями | | | | | | |.