Результати досліджень. 
Молекулярно-генетичний поліморфізм російського осетра Азовського моря за RAPD-маркерами

На першому етапі роботи було проведено скрінінг 20 декануклеотидних RAPD-праймерів довільної послідовності. Задовільні первинні спектри ампліфікації було одержано лише для п’яти праймерів — ОРА-05, ОРА-07, ОРА-10, ОРА-11 та ОРН-07, які й було використано у подальшій роботі. Спектри ампліфікації з іншими олігонуклеотидами характеризувалися значною переампліфікацією (відсутність дискретних смуг за електрофоретичного розподілення у агарозному гелі), недостатньою кількістю ПЛР-смуг або слабкими за інтенсивністю світіння бендами. Оптимізація умов проведення ПЛР для цих праймерів (підвищення температури відпалу, зміна концентрації компонентів реакційної суміші) не сприяла поліпшенню якості спектрів.

Варто зазначити, що отримання чітких, інформативних спектрів вимагало індивідуальної роботи з кожним окремим праймером. Проведені дослідження уможливили виявлення чинників, які найбільшою мірою впливали на якість спектрів продуктів ампліфікації: концентрація хлориду магнію, концентрація препарату ДНК, концентрація праймера у реакційній суміші та кількість циклів ампліфікації. Враховуючи їх, для кожного з використаних праймерів було визначено оптимальні умови проведення ПЛР (табл.1).

Таблиця 1

Результати експериментального підбору умов проведення ПЛР для праймерів ОРА-05, ОРА-07, ОРА-10, ОРА-11 та ОРН-07

З огляду на те, що RAPD-метод є чутливим до змін реакційної суміші та алгоритму її приготування, було застосовано «жорсткі» умови ампліфікації. Насамперед це стосувалось концентрації хлориду магнію та олігонуклеотидних праймерів. Зміни концентрації ДНК-матриці та кількості циклів ампліфікації виявилися менш принциповими для відтворення продуктів ампліфікації, але поліпшували як загальну якість спектрів, так і окремих смуг.

Сумарно за використання 5 RAPD-праймерів було отримано 90 продуктів ампліфікації, 41 (45,55%) з яких виявилися поліморфними у досліджених генотипів (табл.2). Найвищій рівень поліморфізму спостерігали за використання праймера ОРН-07 — 62%. Найбільшу кількість локусів для цього типу маркерів було також отримано за ампліфікації ДНК російського осетра з праймером ОРН-07 (26 продуктів ампліфікації) (рис.), найменшу — з праймером ОРА-11 (14 ампліконів). Значення середньої кількості локусів на особину у досліджених осетрів Азовського моря для всіх праймерів склало 13,3.

Таблиця 2

Характеристика RAPD-спектрів російського осетра

Розподіл RAPD-ампліконів досліджених особин російського осетра за молекулярною масою мав певні особливості. Загалом молекулярна маса продуктів ПЛР склала 3600−300 п.о. У досліджених зразках переважали амплікони з малою молекулярною масою. Зокрема, амплікони розміром до 1000 п.о. склали близько 57% від загальної кількості, а продукти ПЛР розміром 1000−2000 п.о. — 25%. Менше інших у спектрах зустрічалися амплікони розміром більш як 2000 п.о., їх частка склала 18%.

Отримані поліморфні спектри було використано для визначення генетичних дистанцій між дослідженими осетрами за використання комп’ютерної програми MEGA 4. Загалом генетичні дистанції були порівняно невеликими (dm=0,0346±0,0012), але достатніми для дискримінації досліджених генотипів.

Рис. Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації RAPD-PCR з праймером ОР -07: М — маркер молекулярної маси, 1−20 — зразки російського осетра.

Таким чином, нами було визначено поліморфні молекулярно-генетичні RAPD-маркери і досліджено інформативність спектрів ампліфікації за генетичного аналізу російського осетра Азовського моря. Отримані результати буде використано для комплексної оцінки генетичної різноманітності азовської популяції з метою збереження і відтворення цінних аборигених генотипів російського осетра.